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trazol(r1021-r1022)

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r1021(20次) r1022(100次)

trazol

产品说明

trazol可以从动物组织、植物材料、各种微生物以及培养细胞等组织材料中提取总rna。样品在trazol中能够充分被裂解,在加入氯仿离心后,溶液会形成上清层、中间层和有机层(下层),rna分布在上清层中,收集上清层后,经异丙醇沉淀便可以回收得到总rna。经本制品提取的总rna纯度高,基本不含蛋白质及基因组dna,提取的rna可以直接用于northern杂交、斑点杂交、mrna纯化、体外翻译、rna分解酶的保护分析、rt-pcr、构建cdna文库等各种分子生物学实验。

 

产品组分

货号

r102120次)

r1022100次)

trazol

20 ml

100 ml

说明书

1

1

需要自备氯仿、异丙醇、rnase-free 75%乙醇、depc处理水(r2041/r2042

 

保存条件

室温运输,2-8℃避光保存。

 

注意事项

●   trazol具有腐蚀性,操作过程中应做好防护,避免直接接触皮肤或吸入口鼻。沾染后应立即用大量清水冲洗,必要时请就医处理。

●   严防操作环境、使用的容器、耗材和试剂的rnase污染。操作过程中勤换手套。

●   根据起始材料量的不同使用不同体积的溶液(见下表)。过多或过少的使用量都可能影响rna的质量或产量。若起始材料量很少,rna预计产量很低,在异丙醇沉淀时,可加入20 mg/ml肝糖原溶液0.5-1 μl促进rna沉淀。

●   不同起始材料试剂用量及trazol用量。

样品用量

trazol的用量

10cm2的贴壁培养细胞

1 ml

107的悬浮培养细胞

1-2 ml

100 μl的白细胞

2 ml

50-100 mg的普通组织样品

1 ml

50-100 mg的特殊组织样品(肝、脾、骨及软骨等)

2 ml

15-30 mg的植物材料(多糖和多酚含量不高的)

1 ml

●   使用本产品提取的rna一般不含有dna污染。在极少数情况下(与组织ph值等相关),如果有dna污染而又必须去除,则可以用rnase-freednase处理样品。

●   防止dna污染方法:a. 减少样本起始用量,如将100 mg的植物组织减少为50 mg,将30 mg的动物组织减少为10 mg

                      b. 在加入trazol之后加入5-10 ul 3m naac(ph5.2)

●   请严格遵照操作步骤操作。

●   有关rna的吸光度说明如下:

260 nm320 nm230 nm280 nm下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。od260/od280r)体现了rna中的蛋白质等有机物的污染程度,质量较好的rnar值应在1.8-2.0之间,当r<1.8时,溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显;当r>2.2时,说明rna已经被水解成了单核苷酸。在对核酸进行吸光度检测时,需要注意稀释液应使用te buffer

●   rna浓度=od260-od320×稀释倍数×0.04 μg/μl

 

 

 

操作步骤

1.      实验样品的研磨和匀浆

a. 贴壁培养细胞

倒出培养液,用1x pbs清洗一次,每10 cm2生长的培养细胞中加入1mltrazol,水平放置片刻,使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞,然后使用移液枪吹打细胞使其脱落(对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞)。将内含细胞的裂解液转移至离心管中,用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。室温静置5 min

b. 悬浮培养细胞

将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中,8,000 rpm4℃离心2 min,弃上清,向每107个细胞中加入l-2 mltrazol。用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀,室温静置5 min

c. 动物组织、植物材料样品

将超低温冻结的rna提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研杵研磨组织,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒,如果没有研磨彻底会影响rna的收率和质量)。对于普通的rna提取样品,可以向研钵中加入适量的trazol,将研磨成粉末状的样品完全覆盖,然后室温静置,直至样品完全融化,再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。对于特殊样品,如肝、脾、骨及软骨等,可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的trazol的匀浆管中,把匀浆管置于冰浴中进行匀浆,直至匀浆液呈无颗粒透明状。将匀浆液转移至离心管中,室温静置5 min12,000 rpm 4 ℃离心5 min,小心吸取上清液,移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。

 

2.      total rna的提取

向上述步骤中的匀浆裂解液中加入氯仿(trazol1/5体积量),盖紧离心管盖,用力振荡(氯仿沸点低、易挥发,振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待充分乳化溶液呈乳白状(无分相现象)后,再室温静置2 min

2  12,000 rpm 4 ℃离心10 min

从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分为三层,即:无色的上清液、中间的白色层及带有颜色的下层有机相,吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。

(如样品含有较多多糖多酚,请增加以下步骤:在上清液中加入0.2x上清液体积的5 m nacl1x上清液体积的酚/氯仿(1:1),混匀,12000 rpm离心5-10 min ,取上清液加入等体积氯仿,混匀,12000 rpm 离心 5-10 min,至第4步。)

向上清中加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,在15-30℃下静置10 min

5  12,000 rpm 4℃离心10 min。一般在离心后,试管底部会出现沉淀。

 

3.      rna沉淀的清洗

小心弃去上清,缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇1 ml(切勿触及沉淀),轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁,12,000 rpm4 ℃离心2 min后小心弃去乙醇(为了更好地控制rna中的盐离子含量,应尽量除净乙醇),重复洗涤一次。

 

4.      rna的溶解

室温干燥沉淀2-5 min(不可以离心或加热干燥,否则rna将会很难溶解),加入适量的rnase-free水溶解沉淀,必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀,待rna沉淀完全溶解后于-80℃保存。



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