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rt-kit(逆转录试剂盒)(r1011-r1012)

促销: 780.00~3250.00

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r1011 (20次) r1012 (100次)

rt-pcr kit(逆转录试剂盒)

产品说明

rt-pcr kit(逆转录试剂盒)是专为两步法rt-pcr第一步实验配制的、具有高灵敏度的rt-pcr反应系统。该系统合理配备了与cdna第一链合成反应相关的各种组分,优化的体系保证了m-mlv具有高效的逆转录酶活性,所得cdna对后续的pcr或定量pcr实验兼容性好,可用于检测稀有基因的表达、从极少数细胞中定量检测特定mrna的表达水平、克隆特定基因的cdna片段等。

m-mlv逆转录酶是由一个71 kd的单亚基组成的重组型dna逆转录聚合酶。可以催化以rnadnarna杂交链为模板的互补dna 的聚合反应。本酶经修饰rnase h活性比普通的逆转录酶要弱很多,因此在合成第一链cdna的过程中,可保证rna的降解程度较低,从而使得率提高。

产品组分

货号

r101120次)

r1012100次)

m-mlv200u/µl

20 μl

100 μl

rnasin40u/µl

12 μl

60 μl

oligo d(t)15 primer50 μm

20 μl

100 μl

random primer50 μm

20 μl

100 μl

5xfirst-strand buffer

80 μl

400 μl

rnase-free ddh2o

1 ml

1 ml×5

dntps(10mm each)

50 μl

250 μl

r1011可进行20次逆转录反应,r1012可进行100次逆转录反应(20 μl 标准pcr反应体系,每次使用 m-mlv 1μl)。

m-mlv 储存液

20 mm tris-hcl (ph 7.5)

200 mm nacl

0.1 mm edta

1 mm dtt

0.01% np-40

50% glycerol

 

5xfirst-strand buffer 成分

250 mm tris-hcl (ph 8.3 at 25℃)

375 mm kcl

15 mm mgcl2

50 mm dtt

 

质量检测

逆转录酶活性检测

使用[32p]dctp作为标记,200 u m-mlv1μg1.2 kbrna为模板进逆转录反应,最低可得到120ngcdna,所得cdna长度 > 全长的90%

核酸外切酶活性检测

混合50ng的标记dna rna200u m-mlv反应缓冲液体系中,37℃温浴1 h,检测dnarna降解都不到总量的1%

 

适用范围

第一链cdna 合成

cdna文库构建

rt-pcr

引物延伸

3'5' race

 

注意事项

l  成功的cdna合成来自高质量的rna。高质量的rna至少应保证全长的完整性并且不含逆转录酶的抑制剂,如edta sds。用于cdna合成反应的溶液试剂尽可能用depc进行处理,并在高压灭菌后使用。有些试剂不能用高压灭菌处理时,首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后,再将溶液进行过滤除菌处理。

l  为了增加贮存rna样品的稳定性,可以将rna溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存 rna 的甲酰胺一定不能含有降解rna的杂物。来源于胰脏的rna至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用rna时,可以使用下列方法沉淀rna:加入nacl0.2 m同时加入4倍体积的乙醇,室温放置3-5 min10,000 rpm离心5 min

l  在逆转录反应中经常加入rnase抑制剂(rnasin)以增加cdna合成的长度和产量。在第一链合成反应中,rnase抑制剂在缓冲液和还原剂(如 dtt)存在的条件下加入,因为cdna合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放出rnase。但是rnase抑制剂仅防止rnase abc rna的降解,并不能防止皮肤上的rnase,因此尽管使用了rnase抑制剂,也要小心不要从手指上引入rnase

l  较高的保温温度有助于rna二级结构的打开,增加反应的产量。

l  使用简单的rna纯化方法即可获得满足rt-pcr反应的rna,但为了保证实验的成功率,建议使用gtc法(异硫氰酸胍法)制备的高纯度rna

l  为防止rna降解,应尽量避免反复冻融,最好保存于-70℃

l  最佳的pcr反应条件,因pcr扩增仪的不同而不同,所以在使用您的样品之前最好先试做一下control反应,以确定最佳的pcr反应条件。

l  cdna产物应置于-20℃保存。

l  当以cdna为模板进行pcr之前,使用rnase h处理cdna,可以提高pcr反应的灵敏度。

 

操作步骤

1 在冰浴的无菌离心管中配制下列混合物

1-5μg rna

1μl oligo(dt)15 random primer

rnase-free ddh2o13.4μl

2进行变性退火反应

70℃温浴5 min,

简短离心后冰浴5 min

3在上述离心管中配制反转录反应液

4 μl  5×first-strand buffer

1 μl  dntps10 mm each

0.6μl  rnasin ,

1 μl   m-mlv

4按下列条件进行反转录反应

oligo (dt)15 42℃温浴60 min

random primer 37℃温浴60 min

5终止反应

70℃温浴5 min终止反应,置冰上进行后续实验或-20℃保存。

6rnase-free ddh2o将反应体系稀释到50μl,取2-5μl进行pcr扩增反应。

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