k8凯发app的产品中心 > rna相关产品 > m-mlv(重组型逆转录酶)(r1041-r1042)

m-mlv(重组型逆转录酶)(r1041-r1042)

促销: 325.00~585.00

分享

运费 ¥0.00
r1041( 25次) r1042( 50次)

m-mlv 逆转录酶

产品说明

m-mlv逆转录酶是由一个 71 kd的单亚基组成的重组型dna逆转录聚合酶。可以催化以rnadnarna杂交链为模板的互补dna 的聚合反应。本酶经修饰rnase h活性比普通的逆转录酶要弱很多,因此在合成第一链cdna的过程中,可保证rna的降解程度较低,从而使得率提高。

 

产品组分

组分

r1041

r1042

m-mlv (200u/μl)

5000u/25 μl

10000u/50 μl

first-strand buffer

100 μl

200 μl

r1041可进行25次逆转录反应,r1042可进行50次逆转录反应(20 μl 标准 pcr 反应体系,每次使用 m-mlv 1 μl)。

m-mlv 储存液成分

20 mm tris-hcl (ph 7.5)200 mm nacl0.1 mm edta1 mm dtt0.01% np-4050% glycerol

5x first-strand buffer 成分

250 mm tris-hcl (ph 8.3 at 25℃)375 mm kcl15 mm mgcl250 mm dtt

 

保存条件

-20℃保存,避免反复冻融。

 

质量检测

逆转录酶活性检测

使用[32p]dctp作为标记,200 um-mlv1μg1.2 kbrna为模板进行逆转录反应,最低可得到120 ngcdna,所得cdna长度 > 全长的90%

核酸外切酶活性检测

混合50 ng的标记dnarna200 u m-mlv反应缓冲液体系中,37℃温浴1 h,检测dnarna降解都不到总量的1%

核酸内切酶活性检测

混合1μgⅰ型超螺旋质粒dna500 u m-mlv反应缓冲液体系中,37℃温浴1 h,琼脂糖电泳检测,无明显的剪切。

 

适用范围

第一链cdna 合成;cdna 文库构建;rt-pcr;引物延伸;3' 5' race

 

注意事项

l  成功的cdna合成来自高质量的rna。高质量的rna至少应保证全长的完整性并且不含逆转录酶的抑制剂,如edta sds。用于cdna合成反应的溶液试剂尽可能用depc进行处理,并在高压灭菌后使用。有些试剂不能用高压灭菌处理时,首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后,再将溶液进行过滤除菌处理。

l  为了增加贮存rna样品的稳定性,可以将rna溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存 rna 的甲酰胺一定不能含有降解rna的杂物。来源于胰脏的rna至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用rna时,可以使用下列方法沉淀rna:加入nacl0.2 m同时加入4倍体积的乙醇,室温放置3-5 min10,000 rpm离心5 min

l  在逆转录反应中经常加入rnase抑制剂(rnasin)以增加cdna合成的长度和产量。在第一链合成反应中,rnase抑制剂在缓冲液和还原剂(如 dtt)存在的条件下加入,因为cdna合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放出rnase。但是rnase抑制剂仅防止rnase abc rna的降解,并不能防止皮肤上的rnase,因此尽管使用了rnase抑制剂,也要小心不要从手指上引入rnase

l  较高的保温温度有助于rna二级结构的打开,增加反应的产量。

l  使用简单的rna纯化方法即可获得满足rt-pcr反应的rna,但为了保证实验的成功率,建议使用gtc法(异硫氰酸胍法)制备的高纯度rna

l  为防止rna降解,应尽量避免反复冻融,最好保存于-70℃

l  最佳的pcr反应条件,因pcr扩增仪的不同而不同,所以在使用您的样品之前最好先试做一下control反应,以确定最佳的pcr反应条件。

l  cdna产物应置于-20℃保存。

l  当以cdna为模板进行pcr之前,使用rnase h处理cdna,可以提高pcr反应的灵敏度。

 

操作步骤

1 在冰浴的无菌离心管中配制下列混合物

 rna

1-5 μg

oligo (dt)15 random primer

1 μl

rnase-free ddh2o

to 13.4 μl


2
进行变性退火反应

70℃温浴5 min,简短离心后冰浴5 min

3 在上述离心管中配制反转录反应液

 上述反应液

13.4 μl

5× first-strand buffer

4 μl

dntps10 mm

1 μl

rnasin

0.6 μl

m-mlv

1 μl

total

20 μl


4
按下列条件进行反转录反应

oligo (dt)15 42℃温浴60 min

random primer 37℃温浴60 min

5 终止反应

70℃温浴5 min终止反应,置冰上进行后续实验或-20℃保存。

6 rnase-free ddh2o将反应体系稀释到50μl,取2-5μl进行pcr扩增反应。

姓名
电话号码
电子邮箱
公司名称
地址
留言*
 
验证码
提交