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pfu dna高保真聚合酶(p1021-p1022-p1023-p1024)

促销: 195.00~832.00

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p1021(250u) p1022*(250u) p1023(1000u) p1024(1000u)

pfu dna聚合酶

cat. #p1021p1022p1023p1024

产品简介

pfu dna聚合酶是极端嗜热性细菌pyrococcus furiosus来源的高度热稳定dna聚合酶,分子量为90 kd。其保真性是普通taq dna聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达5 kb(简单模板)。延伸速度为2min/kb70~75℃,简单模板可达20s/kb)。该酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,扩增产物具有平末端。

产品组成

component

p1021

250u

p1022

250u

p1023

1,000u

p1024

1,000u

pfu dna聚合酶(5u/μl

50 μl

50 μl

200 μl

200 μl

10× pfu   buffermg2 plus[1]

1.25 ml

1.25 ml

1.25 ml × 2

1.25 ml × 2

6× loading buffer[2]

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

dntps2.5mm[3]

-

1 ml

-

1 ml × 2

[1] 10× pfu buffer分为mg2  plusmg2  free两种包装,可方便选择。如无特别说明提供10× pfu buffer(mg2  plus)mg2  free10×pfu buffer提供25 mm mgcl2

[2] 6× loading buffer,如有需要可单独购买(cat. #m9041)。

[3] dntpsdatpdgtpdctpdttp等摩尔混合物,p1021/p1023不含dntps,如有需要请单独购买(cat. #p9011/p9012/p9013)。

活性定义

一个活性单位(u)指用活性化的大马哈鱼精子dna作为模板/引物,在72℃30 min内,摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

保存条件

-20℃保存2年。

质量控制

纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测:pcr方法检测无宿主残余dna,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。

应用举例

1. 配制反应体系

请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:

ordinal

component

volume

(50 μl reaction volume)

final   concentration

(50 μl reaction volume)

1

10× pfu   buffermg2 plus

5 μl

2

dntps2.5mm

4 μl

0.4 mm

3

upstream primer (10 μm)[1]

2 μl

0.4 μm

4

downstream primer (10 μm)[1]

2 μl

0.4 μm

5

pfu dna聚合酶(5u/μl[2]

0.5 μl-1 μl

2.5u-5u

6

template dna[3]

1-4 μl

<1μg

7

超纯水[4]

to 50 μl

-

optional

mgcl2(mgso4)/pcr enhancer[5]

variable

-

[1] 引物终浓度建议范围:0.1-1 μm。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度

[2] 根据目的片段扩增的难易程度调整dna聚合酶的用量。

[3] 不同模板最佳用量不同,部分dna模板建议用量如下表(50 μl反应体系)。

template

dosage

人类基因组dna

0.1μg-1μg

λdna

0.5ng-5ng

大肠杆菌基因组dna

10ng-100ng

质粒dna

0.1ng-10ng

[4] 可单独订购超纯水(cat. #p9021/p9022/p9023)。

[5] 可单独订购25mm mgcl2cat. #p9031)和pcr enhancercat. #p9041)。

2. 设定反应程序进行pcr反应

stage

temperature

time

number of cycles

initial denaturation

94℃

3 min

1

denaturation

94℃

30 sec

25-35

annealing

55-68℃[1]

30 sec

extension

72℃

variable[2]

final extension

72℃

5-10 min

1

[1] 退火温度应根据tm值较低的引物来设。

[2] 延伸时间按2min/kb来设最佳(简单模板可达20s/kb)。

3. 分析结果

将产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要,可进行割胶回收。

无产物或产物量少的改进措施有:1调整退火温度;2减少抑制剂的影响,如提取的基因组dna中含有抑制扩增的成分,需要高倍稀释(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脱,提高模板dna的纯度;4使用pcr添加剂,如pcr enhancercat. #p9041mgcl2cat. #p9031等可提高产量。

操作注意事项

1 室温下pfu dna聚合酶有一定的活性,为避免发生非特异性扩增,请于冰上配置反应体系,并且最后添加pfu dna聚合酶或模板dna

2 pfu dna聚合酶的扩增产物只有平末端,可直接用于平末端连接。如要进行ta克隆,请先进行加a反应,以提高克隆效率。(加a反应:参考如下体系,72℃15-30min

pcr(纯化)产物

1-7 μl

10× taq buffermg2 plus

1 μl

datp

0.2 mm

taq dna聚合酶

5u

超纯水

to 10 μl

碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。pfu dna聚合酶的碱基错误率为1×10-6

4 dutpditp和含有这些核苷酸的引物不能用于pfu dna聚合酶催化的pcr扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的dna模板结合后会中止dna聚合反应。

引物设计注意事项

引物长度一般在15-30个碱基之间;上下游引物3’末端避免互补,避免出现3个以上重复的gc,或出现发夹结构,否则会产生非特异性扩增;gc含量控制在40-60%,且上下游引物gc含量尽量接近;tm值控制在55-65℃之间,且上下游引物tm值尽量接近,额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列,不参与tm值计算。

相关产品

名称

货号

规格

pcr mix

p2011/p2012/p2013/p2014/p2015

1ml/5ml/10ml/50ml/100ml

power green qpcr mix

p2101/p2102/p2103/p2104/p2105

1ml/5ml/10ml/50ml/100ml

1kb ladder

m1181/m1182

50/250

dstm5000

m1111/m1112

60/300

高纯度质粒小提试剂盒

n1011/n1012/n1013

50/100/200

通用rna提取试剂盒

r1051

50

基因组dna快速提取试剂盒

n1111/n1112

50/100

dna凝胶回收试剂盒

n1071/n1072/n1073

50/100/200

rt-pcr kit

r1011/r1012

20/100

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