怎样在线做pcr引物设计
发布时间:2017-07-27
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要先对pcr目的序列的长度有个大致估计:

第一步:找到primer3的站点。你不用记住这个站点,但是要记住“primer3”这个词,然后打开googlek8凯发app首页,输入primer3,跳出来的第一个项目就是了“”

网址是。


第二步:贴上模板序列。进入primer3站点,可以看到一个引物设计的界面。在“paste source sequence below (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'->3'方向的,数字或者空格都没关系,软件会自动过滤的。


第三步:重要参数设定。首先是“product size ranges”,如果你不希望软件给你随便做的话,首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000,这个你得自己改,如果你希望产物的大小符合你的预期,尽可能把范围改小,比如480-500,具体看情况调整。第二个参数是“primer size”,默认值一般可以用,但是,当你用熟了这个软件,你自己就知道该怎么改了。第三个参数是”primer tm”这个和primer size差不多。



第四步:pick primers: 点一下这个按钮,符合你大小预期的primer就出来了,看看primer3 output的界面,多么漂亮!你要的primer出来了,而且有primer在序列上的位置比对图,还要primer本身的信息,包括位置,长度,tm,gc含量,任何位置互补碱基数,3'端互补碱基数,以及引物序列,(注意,下游引物是5'->3'),还要产物大小,两引物间任意互补碱基数,两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内,但还不是最佳,将会给出警告。



第五步:引物设计检验:可以仅仅设计一向引物,只要在pick left primer或者pick right primer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物,放在primer框里,(注意,下游引物的书写反向仍然是5'->3')如果符合设定的条件,软件将对给出引物评分,同时给出警告信息,根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可,警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物,最好都要检查一下,这样就可以避免被别人有意无意误导。至于rt-pcr所用的引物,最好是使得产物跨过内含子,这样避免潜在dna对rt-pcr的干扰。实际做引物的时候,要把内含子都去掉,仅仅把外显子序列放入源序列框中,并且通过自定义引物设计的方法,使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子pcr,我将抽空另做说明。

至于设计出来的引物的实际效果,根据我的经验,一般情况下都能做到pcr一次成功,也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果,但是不管怎么说,软件做引物可以让自己心中有数。最后,good luck to everyone.