pcr常见问题分析之二/克隆
发布时间:2017-07-27
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1 产物的最优条件是什么? 
最佳插入片段:载体比需实验确定。1:1(插入片段:载体)常为最佳比,摩尔数比1:8或8:1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2x连接液, 50ng质粒,1weiss单位的t4连接酶,插入片段共10ul。室温保温1小时,或4℃过夜。在这2种温度下,缺t-凸出端的载体会自连,产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数要求,为提高连接效率,需4℃过夜。 

2  产物是否需要用凝胶纯化? 
如凝胶分析扩增产物只有一条带,不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带,可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高,这会产生高比例的带有引物二聚体的,而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。 

3  如果没有回收到目的片段,还需要作什么对照实验? 
a)涂布未转化的感受态细胞。 
如有菌落,表明氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或产生氨苄抗型的菌落。 
b)转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率。 
例如,将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用soc稀释到1000ul后,用100ul铺板。培养过夜,产生1000个菌落。转化率为: 产生菌落的总数/铺板的总量。 
铺板的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng ,用soc稀释到1000u后含10 ng,用1/10铺板,共用1 ng 。转化率为: 
1000克隆x10(3次方) ng /铺板1 ng  ug=10(6次方)cfu/ ug 
转化pgem-t应用10(8次方)cfu/ ug感受态细胞 
如没有菌落或少有菌落,感受态细胞的转化率太低。 
c)如用pgem-t正对照,或产物,产生>20-40蓝斑(用指定步骤10(8次方)cfu/ ug感受态细胞),表明载体失去t。可能是连接酶污染了核酸酶。t4 连接酶(m1801,m1804,m1794)质量标准好无核酸酶污染,不应用其它来源的t4 连接酶替换。 
d)用pgem-t或pgem-t easy载体,连接pgem-t正对照,转化高频率感受态细胞(10(8次方)cfu/ug),按照指定的实验步骤,可得100个菌落,其中60%应为白斑,如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落,连接有问题。


4  对照实验结果好,却没有回收到目的片段,实验出了什么问题? 
a)连接用室温保温1小时,能满足大多数克隆,为提高效率,需4℃过夜。 
b)插入片段带有污染,使3`-t缺失,或抑制连接,抑制转化。为此,将插入片段和pgem-t正对照混合,再连接。如降低了对照的菌落数,插入片段需纯化,或重新制备。如产生大量的蓝斑,插入片段污染有核酸酶,使pgem-t或pgem-t easy载体3`-t缺失。 
c)插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段,因受uv过度照射,时有发生。uv过度照射会产生嘧啶二聚体,不利于连接,必需重新纯化。 
d)带有修复功能的耐热聚合酶的扩增产物末端无a,后者是pgem-t或pgem-t easy载体克隆所需。加taq 聚合酶和核苷酸可在末端加a。详情查pgem-t pgem-t easy载体技术资料(tm042)。 
e)高度重复序列可能会不稳定,在扩增中产生缺失和重排,如发现插入片段高频率地产生缺失和重排,需用重组缺陷大肠杆菌菌株,如sure细胞